주산기 저산소성 허혈성 뇌병증에서 eNOS 유전자 다형성

Min Cho(조국 교수 딸 당시 한영외고 2학년)

Kwang-Sun Hyun(당시 단국대학교 박사후 과정 연구원)

David Chanwook Chung(단국대병원 소아과)

In-Young Choi(단국대학교 병원 임상강사 현재, 가톨릭대 의대 교수)

Myeung Ju Kim(김명주 단국대 교수)

Young Pyo Chang(장영표 단국대 교수)

배경: 주산기 저산소성 허혈성 뇌병증 (HIE)에서는 뇌 혈류가 손상되고 산화 질소 합성효소 (NOS)의 활성이 현저히 증가한다. 뇌졸중 발생과 관련하여, 내피 NOS (eNOS) 다형성이 잘 알려져있다.

방법: eNOS 유전자의 임상적으로 관련있는 3 가지 다형성은 주산기 HIE (HIE 군)가있는 37 명의 조산아/영아와 주산기에 문제가 없는 54 명의 정상 신생아 대조군에서 중합 효소 연쇄 반응을 사용하거나 제한 단편 효소 소화를 제한하지 않고 결정하였다. 유전자형, 대립 유전자 및 haplotype형 빈도의 차이를 그룹간에 평가 하였다.

결과 : 대립 유전자 빈도의 분석은 Glu298Asp의 G 대립 유전자가 대조군보다 HIE 그룹에서 더 빈번하다는 것을 보여 주었다. 대조군과 HIE로 발생한 합병증을 갖는 각 하위 군 간의 비교는 T-786C의 TC 유전자형 및 C 대립 유전자가 대조군에서보다 신생아의 지속적인 폐 고혈압 (PPHN: persistent pulmonary hypertension of the newborn) 환자에서 더 흔함을 보여 주었다. A b T haplotype형의 빈도는 대조군보다 HIE 환자에서 더 낮았다.

결론: Glu298Asp의 G 대립 유전자는 주산기 HIE와 관련이 있었으며, T-786C의 TC 유전자형과 C 대립 유전자는 PPHN과 관련이 있었다.

서론:

산화 질소 (NO)는 NO 합성효소 (NOS)에 의한 L- 아르기닌의 L- 시트룰린으로의 산화로부터 생성된다. 내피 세포는 혈관 색조를 조절하는데 중요한 생리학적 역할을 하는 내피 NOS (eNOS)를 통해 NO(일산화 질소)를 생성 할 수있다. 또한, NO는 평활근 세포 증식을 조절하고, 내피에 대한 백혈구 부착 및 혈소판 응집의 억제를 약화시킨다. NO는 많은 인간 심혈관 질환의 발병에서 중요한 역할을 한다. 기저 NO의 감소 된 생성 및 활성은 인간에서 고혈압, 혈전증, 혈관 경련 및 죽상 경화증을 유발할 수있다. 혈관에서 NO 생성량은 eNOS 유전자에 의해 제어되는 바와 같이 eNOS 발현 정도와 밀접한 상관 관계가 있을 수 있다. 따라서, eNOS 다형성의 가변성의 조사는 허혈성 심장 질환 및 뇌 혈관 질환과 같은 많은 인간 혈관 질환과의 유전적 연관성을 밝힐 수 있다. eNOS 유전자의 다형성은 노화와 뇌졸중과 관련하여 다양한 인종 그룹에서 이전에 조사되었다. 이러한 연구 중 일부는 상충되는 결과를 보고했지만, eNOS 다형성의 연관성은 뇌졸중과 일관되게 상관 관계가 있었다.

eNOS 유전자는 염색체 7q35-36에 위치하고 21kb에 걸친 26 개의 엑손으로 구성된다. eNOS 유전자의 여러 다형성 중 뇌혈관 질환과의 관련성을 검출하기 위해 세 가지 유형이 조사되었다. 엑손 7의 Glu298Asp 다형성, 탠덤 반복 횟수 [VNTR, 27 bp 반복] 다형성 intron 4 및 eNOS의 5'-플 랭킹 영역에서 T-786C 다형성이다. 분만중 신생아에서 가장 흔하게 인식되는 주산기 저산소성 허혈성 뇌병증 (HIE)[태아 뇌졸중]은 중증의 장기적인 신경학적 결함의 중요한 원인이다. 주산기 저산소증 허혈성 뇌병증(HIE) 동안 손상된 뇌 혈류는 NO의 활성과 관련이 있다고, 입증되었다. 내피에 의한 NO 생성 증가는 뇌혈관 확장으로 이어진다. 이로 인해 뇌혈류가 증가하여 보호될 수 있다. 그러나, 허혈성 에피소드 동안, NO의 혈관 확장 효과로 인한 뇌혈류의 증가는 재관류 손상을 일으킬 수 있다. 또한, 저산소증-허혈성 에피소드 동안, 과도한 NO 생성은 과산화물과 반응하여, 강력한 과산화 질소를 생성하여 지질 과산화를 활성화시키고 뉴런 손상을 유발한다. 주산기 HIE 환자의 경우, eNOS 다형성의 가변성은 신생아의 뇌에서 eNOS 활성 및 NO 생성 모두에 영향을 줄 수 있으며, 이는 주산기 HIE의 중증도에 의해 나타나는 상이한 임상 결과를 초래할 수 있다.

재료 및 방법:

실험 주제

이 연구는 중등도 내지 중증의 주산기 HIE를 가진 37 명(대조군)의 단기 신생아와 신생아 집중 치료실 (NICU)에 입원한 2002 년부터 2004 년까지 단국대학교 병원의 유아 요양원에 있던, 주산기 문제가 없는 54명의 정상 신생아 신생아(대조군)를 포함했다. 주산기 HIE를 가진 모든 영아는 주산기 질식의 진단 기준을 충족 시켰고

주산기 질식과 관련된 급성 뇌병증을 나타냈다. HIE의 임상 과정은 Sarnat 분류에 따라 영향을 받는 모든 영아에 대해 중등도 수준이었다. HIE를 가진 영아의 재태 연령(gestational age)은> 36주 였고, 5분에 Apgar 점수는 모든 영아는 관련이 없는 가족력이 없는 동질의 한국인이었다. 모든 영아의 부모로부터 사전 동의를 얻었다. 이 연구는 단국대학교 병원 임상 시험 심사위원회의 승인을 받았다.

DNA 추출 및 유전자형 분석

말초 혈액 샘플을 채취하고, 혈액을 EDTA 튜브에 첨가 하였다; 혈액 백혈구로부터 게놈 DNA를 추출 하였다. eNOS 유전자의 임상적으로 관련된 3 가지 다형성은 이전에 기술 된 바와 같이 모든 영아에서 측정되었다. Primer(각각 5'-AAG GCA GGA GAC AGT GGA TGG A-3 '및 5'-CCC AGT CAA TCC CTT TGG TGC TCA-3'). 증폭된 258-bp 단편을 제한 효소인 BanII로 분해하여, 단편이 2개의 단편, 163bp 및 85bp 단편(야생형 대립 유전자 ''G '')으로 분해되거나 소화되지 않도록 하였다. (변이 대립 유전자 ''A ''). 이들 단편을 12 % 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 의해 분석하고, 은 염색에 의해 시각화 하였다. eNOS의 5'-플랭킹 영역에서 정방향 및 역방향 프라이머의 T-786C 다형성의 검출을 위해, , 5′-TGG AGA GTG CTG GTG TAC CCC A-3′and 5′-GCC TCC ACC CCC ACC CTG TC-3′, PCR에서 각각 사용되었다. 증폭 된 생성물을 MspI로 분해하여, 야생형 대립 유전자 (대립 유전자 ''T '')에 대해 140 bp 및 40 bp의 단편을 생성하거나, 변이체 (대립 유전자 ''C '')의 경우 90, 50 및 40 bp 였다. 단편을 12 % 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 의해 분리하고 은 염색에 의해 시각화 하였다. 인트론 4에서 VNTR 다형성의 검출은 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수행되었고, 각각 5′-AGG CCC TAT GGT AGT GCC TTT-3′and 5′-TCT CTT AGT GCT GTG GTC AC-3′ 였다. PCR 생성물을 2.5 % 아가 로스 겔 전기 영동에 의해 분리하고 etbr 염색에 의해 시각화 하였다. 420 bp 야생형 생성물에는 27 bp 반복 체 5 개 ( 'b' '대립 유전자)가 포함되었고 ,393 bp 변종에는 27 bp 반복체 4 개 ('a'대립 유전자)가 포함되어 있다. eNOS 유전자의 3 가지 다형성에 대한 유전자형 분석이 그림 1에 게재되어있다. VNTR의 유전자형 4aa 및 T-786C의 CC는 본 연구에 포함된 영아에서 검출되지 않았다.

통계 분석

데이터는 Windows 용 SPSS 통계 패키지 프로그램, 버전 14.0 (미국 일리노이 주 시카고, SPSS Inc)을 사용하여 분석되었다. 유전자형의 관찰된 빈도는 카이 자승 테스트에 의해 하디 와인버그 평형 하에서 예상되는 빈도와 비교되었다. 그룹 간의 유전자형, 대립 유전자 및 일배 체형 빈도의 차이는 지시 된대로 카이 자승 테스트, 스튜던트 t- 테스트 또는, 피셔의 정확한 테스트에 의해 평가되었다. p

결과:

이 연구에 포함된 영아의 임상 특성은 표 1에 나와 있다. 출생 평균 체중과 임신 연령은 HIE와 대조군 사이에 유의한 차이가 없었다. 1 및 5 분의 Apgar 점수는 대조군보다 HIE 군에서 유의하게 더 낮았다(p 다른 병원이나 외부 병원에서 태어난 HIE 영아의 수는 21 명 (56.8 %)이지만 대조군에는 없었다. 제왕 절개는 HIE 군에서 22 명 (59.5 %), 대조군에서 15 명 (27.8 %)에서 유의미하게 나타났다 (p 출생 질식과 관련된 Meconium staining 및 태아 절박가사는 HIE 그룹에서만 관찰되었다. 

이후 생략

원본은 https://gall.dcinside.com/board/view/?id=koreauniversity&no=132550&exception_mode=recommend&page=1